雙抗夾心ELISA試劑盒的反應(yīng)時間

   在保證 ELISA 有效檢測病原菌的前提下，快速方便也是雙抗夾心ELISA的必要條件。雙抗夾心ELISA從加入待測抗原到得出結(jié)果，檢測大腸桿菌 O157:H7 共需要5h左右，而間接ELISA則需要7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本論文篩選出的雙抗夾心ELISA檢測大腸桿菌 O157:H7 省去封閉這一步驟。在間接ELISA測定抗原中，封閉一般是*的，因為包被不同濃度抗原不一定可以*覆蓋固相載體表面，如果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標二抗直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測結(jié)果偏高。但是對于雙抗體夾心ELISA來說，在包被捕獲抗體時已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附力來吸附隨后加入的特異性抗體和酶標二抗，這都說明 了雙抗夾心ELISA有不需要封閉的可能，通過正交試驗結(jié)果也證明不封閉可以達到理想實驗效果，而且還縮短了整個檢測流程和時間，說明只要酶標記物是高活性的 并且操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。雙抗夾心ELISA檢測法的特異性和靈敏性抗原抗體的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間，由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特 異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。本實驗以大腸桿菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 為抗原用來檢測本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌 O157:H7 呈明顯陽性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)， 說明本方法對大腸桿菌 O157:H7 具有明顯的檢測特異 性，而對所測定的其它菌株無交叉反應(yīng)。

   本論文所建立的雙抗夾心ELISA方法對純培養(yǎng)的 大腸桿菌O157:H7檢出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的雙抗夾心 ELISA 檢測大腸桿菌 O157:H7 的檢測限為 10 5 CFU/ml ，建立的雙抗夾心ELISA 檢測大腸桿菌 O157:H7的檢測限為 104CFU/ml，兩者均用單克隆抗體作為檢測抗體，而本方法使用IgY 抗體與兔多克隆抗體，制備相對比單克隆抗體簡單，對試劑成本要求也相對降低，其效果基本達到檢測要求。